От хромосом к молекулам: молекулярная цитогенетика

От хромосом к молекулам: молекулярная цитогенетика

17 марта 2023, 06:02

Бурное развитие генетики и молекулярной биологии в XX веке заложило основы изучения генов на уровне молекул, что сегодня зачастую важнее клеточных исследований, особенно когда речь идет о клинической диагностике, ─ ведь многие молекулярно-генетические методы имеют завидную прогностическую силу. Например, полногеномное секвенирование дает наибольшую информацию при изучении генов и постепенно становится своего рода "мейнстримом", о чем неоднократно уже упоминалось на "Биомолекуле". В то же время, изучающая изменения генома на микрохромосомном уровне цитогенетика (а ей уж более полувека) ─ также по-прежнему актуальна, и на то есть веские причины. Обсудим их в статье, а заодно разберем, какую роль классическая и молекулярная цитогенетика играют в современных клиниках.

Микротесты

Партнер материала — компания " Микротесты Б.М.В.", официальный дистрибьютор зондов для гибридизации in situ. Компания работает на рынке РФ с 2003 г. и успешно участвует в аукционах и тендерах, предоставляет экспертные консультации.

Как все начиналось?

История классической цитологии (исследований клетки) восходит к 17–18 векам, когда активное развитие оптики позволило наблюдать в микроскоп крошечные биологические частицы разного типа, в том числе клетки млекопитающих и человека. Позднее привлекли внимание хромосомы (рис. 1) — в 19 веке; а еще позже, в веке 20-м, — их уже рассматривали в качестве носителей наследственности.

Немалая заслуга всех этих открытий принадлежит труду конкретных ученых: микроскопия развилась во многом благодаря Роберту Гуку и Антонию Ван Левенгуку (см. " 12 методов в картинках: микроскопия" [1]), а идея генетической роли хромосом была сформулирована немецким биологом Теодором Бовери (см. " 100 лет хромосомной теории наследственности (1915–2015)" [2]).

Цитогенетика: как изучают хромосомы сегодня?

Хромосомы можно увидеть в самый обычный световой микроскоп на определенных фазах клеточного цикла (таких как метафаза ), а также наблюдать в них изменения, вызванные мутациями (хромосомные мутации еще известны как "аберрации").

В метафазе митотического деления хромосомы имеют четкую структуру "как из учебника": они похожи на "крестики" с перетяжками по центру (рис. 1), и потому отклонения в них легче идентифицировать.

Классическая клиническая цитогенетика как раз изучает взаимосвязь хромосомных аберраций с заболеваниями человека, а молекулярная цитогенетика для тех же целей применяет не только рутинные цитогенетические техники, но и некоторые подходы молекулярной биологии (зачастую сочетая их между собой).

Например, препараты хромосом можно приготовить, окрасить, затем рассмотреть их под световым микроскопом для поиска хромосомных аберраций, связанных с патологиями, — это классическая цитогенетика и есть. Но можно сделать немного по-другому: на тех же препаратах соединить участок хромосомы с зондом — с особой однонитевой ДНК, имеющей флуоресцентную метку. В этом случае видеть отклонение (или его отсутствие) поможет контрастно светящийся сигнал (рис. 2, рис. 6, рис. 7), и здесь уже мы говорим о применении цитогенетики молекулярной (все подробности ниже).

Методология, или как все это в цитогенетике работает?

Выделенные из организма клетки подготавливают для получения препаратов фиксированных хромосом, а для этого в качестве источника подходят клетки периферической крови, буккальный соскоб (мазок клеток эпителия внутренней стороны щеки), ворсинки хориона (в т.ч. ворсинчатой части плаценты), амниотическая жидкость и пр. [3].

Обычно после отбора клетки размножают в питательной среде, стимулирующей деление (например, можно добавить фитогеммаглютинин), но застопоривающей его в метафазе митоза (а для этого добавляют клеточный яд колхицин, разрушающий митотическое веретено деления) [4]. После окончания культивирования клетки с питательной средой обрабатывают гипотоническим раствором, разобщающим (т.е. отделяющим друг от друга) хромосомы. Далее препарат фиксируют и раскапывают на предметные стекла таким образом, чтобы все хромосомы метафазной пластинки лежали раздельно. Последний этап — окрашивание, и тут есть свои особенности в зависимости от исследовательских целей [5].

Зачастую хромосомы сплошняком прокрашивают по всей длине красителем Романовского—Гимзы (известным также как азур-эозин) — это "рутинное" окрашивание (рис. 3) [6]. После этого все хромосомы окрашены одинаково, из-за чего сходные по размеру и морфологии "экземпляры" трудно отличить, а значит, и идентифицировать. Поэтому такой способ обычно используют для исследований, не требующих изучения всех хромосом набора — например, при выявлении хромосомных перестроек, ассоциированных с мутагенным облучением (см. врезку).

Радиобиология, биодозиметрия и хромосомы

Метод культивирования лимфоцитов периферической крови с фитогеммаглютинином для получения препаратов метафазных хромосом нашел применение не только в диагностике хромосомных болезней. Он также используется для оценки воздействия внешних мутагенов, таких как радиация.

Эта оценка может проводиться и с помощью измерительных приборов, необходимых людям, подвергающимся радиационному облучению при исполнении своих профессиональных обязанностей (работе на атомных электростанциях, утилизации ядерных боеприпасов и пр.). В таких случаях МАГАТЭ рекомендует как ношение индивидуальных дозиметров, так и использование аналогичных стационарных приборов, но этого не всегда достаточно. Дело в том, что чрезвычайный характер ядерных аварий означает неконтролируемую утечку радиации, и здесь в первую очередь необходимо выявить получивших серьезные дозы, чтобы вовремя оказать им необходимую помощь. К сожалению, так часто бывало, что во время подобных инцидентов у людей вблизи источника радиации индивидуальных дозиметров как раз и не было [7], [8]. Здесь-то и может помочь биологическая дозиметрия [8].

Биодозиметрия — это оценка поглощенной дозы ионизирующего излучения с помощью специфических биологических маркеров, наличие и количество которых обычно коррелирует с уровнем облучения. При этом характер предоставляемой ей информации шире данных физической дозиметрии, не учитывающей вариации радиационного отклика у разных людей (индивидуальную радиочувствительность), а также имеющей некоторые сложности в оценке доз поглощенного излучения.

Ведь для точного измерения дозиметр необходимо размещать там, где ожидается максимальное облучение (что получается не всегда [9]), а при отсутствии этого реконструкция дозы может потребовать знания обстоятельств события (времени облучения, его площади, удаленности человека от источника и др.), а также применения косвенных методов оценки (аналитического и численного моделирования), имеющих свои ограничения [10], [11].

Все это особенно актуально для нашей страны, ведь на территории бывшего Советского Союза когда-то произошла одна из величайших в истории радиационных аварий (инцидент на Чернобыльской АЭС 26 апреля 1986 г. [12], [13]). С тех пор немало воды утекло, но значимость контроля радиационных воздействий совсем не утратила актуальность, и даже наоборот [14], [15].

Результаты многолетних исследований также не прошли даром, приведя к выработке принципов корректной биологической индикации, дающей достоверную информацию об эффектах поглощенной дозы на клеточном уровне для лучшей оценки причиненного ущерба и прогноза последствий облучения у конкретного человека.

Анализ хромосомных аберраций в лимфоцитах крови для этих целей особенно актуален — он рекомендован в качестве тест-системы для оценки воздействия радиации международными организациями: ВОЗ, МАГАТЭ и НКДАР ООН, что не случайно, так как лимфоциты периферической крови — уникальная модель изучения радиационного мутагенеза [16]. Выяснилось, что они обладают высокой радиочувствительностью: реагируют на радиацию по-особому (сильней, чем на нерадиационные воздействия) даже в малых дозах. Это выражается в появлении специфических маркеров: стабильных и нестабильных хромосомных обменов (рис. 4), причем чем выше доза, тем их больше.

А поскольку лимфоциты распределяются и перемещаются в кровеносных сосудах по всему телу, забор лишь нескольких миллилитров венозной крови с последующим анализом в них аберраций позволяет оценивать радиационное воздействие на организм человека в целом.

Помимо анализа нестабильных хромосомных аберраций (рис. 3, рис. 4), в биодозиметрии изучают и стабильные аберрации (транслокации ─ их выявляют методом FISH [18] ─ подробнее об этом ниже), что также востребовано, но в другом ключе. Нестабильные хромосомные аберрации, будучи надежным индикатором в течение 3–4 месяцев, далее элиминируются в ряду клеточных делений, снижая тем самым корректность оценки дозы со временем [16]. Стабильные же аберрации могут сохраняться спустя годы после облучения, что позволяет точнее оценивать поглощенную дозу ретроспективно [17].

Некоторым особняком стоит метод оценки с использованием дифференциального окрашивания хромосом, или G-бэндинга (см. ниже) — он позволяет восстановить поглощенную дозу как сразу после облучения, так и в более отдаленной перспективе. Это возможно, так как здесь анализируется каждая хромосома набора, что делает метод в высшей мере информативным, позволяя оценивать уровень как стабильных, так и нестабильных "хромосомных поломок".

Тем не менее, на сегодняшний день для целей биологической дозиметрии G-бэндинг почти не используется, так как он трудоемок, требует высокой квалификации специалистов и значительных временных затрат на анализ.

В цитогенетике хромосомы также делают видимыми в световой микроскоп дифференциальным окрашиванием, методики которого различны (Q-, G-, C-бендинг, и др.), но суть сводится к визуализации в них определенных паттернов. Например, при G-бендинге (рис. 5) перед окраской азур-эозином препараты в течение 5–10 минут обрабатывают трипсином, в результате чего после окрашивания на них проявляется специфичный для каждой рисунок поперечной исчерченности ("полосатости").

Так как расположение светлых и темных полос для каждой хромосомы строго индивидуально, G-бэндинг позволяет идентифицировать их все, а значит, проводить анализ всего хромосомного набора клетки (т.е. осуществлять кариотипирование). Это находит применение в онкогематологии (выявлении маркеров хронического лимфолейкоза), в диагностике причин наследственной хромосомной патологии, для определения причин потери беременности (в том числе, связанной с пороками развития или гибелью плода) и в меньшей степени — при оценке воздействия мутагенных факторов (см. врезку выше).

Молекулярная цитогенетика: уже ближе к ДНК

Основным преимуществом кариотипирования является возможность оценить численные изменения хромосом и структурные аномалии генома (хромосомные перестройки) в одном тесте. Минус в том, что оно может пропустить тонкие хромосомные аномалии, размеры которых меньше предела разрешения светового микроскопа.

Из-за таких ограничений цитогенетический анализ подходит не для всех случаев. Преодолеть некоторые его недостатки может молекулярная цитогенетика.

Диагностика на уровне молекул: в чем плюсы?

Молекулярная цитогенетика, включая современные технологии молекулярной биологии, зачастую позволяет обнаруживать изменения в геноме с большей чувствительностью. Это означает, что можно выявить субмикроскопические хромосомные аномалии, которые с помощью стандартного цитогенетического анализа не диагностируются.

К молекулярной цитогенетике относят:

Метод флуоресцентной in situ-гибридизации (FISH-метод).
Хромосомный микроматричный анализ (ХМА).

FISH — это не только лишь рыба!

Методологически подавляющее большинство методов молекулярной цитогенетики (FISH и ХМА — не исключение) основано на гибридизации — это специфическое связывание генетических последовательностей исследуемого материала с комплементарными пробами (или зондами) — специальным образом сконструированными однонитевыми ДНК.

Для этого материал с исследуемой ДНК сначала обрабатывают специальными реагентами, чтобы облегчить доступ к молекуле нуклеиновой кислоты. Затем добавляют пробу (зонд) и нагревают до 70–80 ^oC для расплавления ДНК (ее денатурации — разрыва водородных связей между двумя комплементарными цепочками, благодаря чему они расплетаются).

Затем препарат выдерживают несколько часов при определенной температуре (обычно 37 ^oC), чтобы исследуемый участок генома накрепко связался с комплементарным ему флуоресцентным ДНК-зондом (это и есть гибридизация). После этого проводят ряд отмывок, наносят контрастный краситель, и вуаля!

То, что получилось, готово к наблюдению во флуоресцентный микроскоп (рис. 6), где сквозь специальные фильтры можно увидеть цветное свечение меченых хромосом (или их участков), по которому судят о наличии или отсутствии хромосомных изменений.

Для чего все это нужно?

Одно из основных преимуществ FISH-исследований, в сравнении с цитогенетическим анализом, заключается в том, что их можно проводить на неделящихся (интерфазных) клетках (рис. 2). При этом можно использовать не только свежеприготовленные препараты, но и уже готовые, имеющиеся в лаборатории (тканевые, клеточные или те же препараты фиксированных хромосом). Это зачастую упрощает и ускоряет анализ (ведь несколько суток на культивирование есть не всегда, в то время как подготовленные образцы зачастую уже в наличии ).

Да и приготовить препараты, для которых культивирование без надобности (например, гистологические срезы), тоже иногда можно быстрее.

Что касается возможностей FISH, то он может, например, выявить делеции (утрата сегмента хромосомы), транслокации (перемещение участка хромосомы с одной на другую), инверсии (поворот сегмента хромосомы на 180^o), дупликации (удвоение сегмента хромосомы) и некоторые другие геномные аномалии [3].

Все это находит применение в разных клинических случаях — для выявления гемобластозов (рис. 6); для определения амплифицированных онкогенов, вызывающих злокачественные сóлидные опухоли (см. рис. 2); как метод диагностики наследственных хромосомных аномалий (рис. 7); и при некоторых других показаниях [4].

Одно из важных применений — ретроспективная биодозиметрия: по возникающим при радиационном воздействии транслокациям можно оценивать повреждения организма даже спустя годы после облучения, так как такие хромосомные обмены стабильны (FISH дает возможность их идентификации в лимфоцитах, подсчета и реконструкции поглощенной дозы на основе их количества [18], см. врезку выше).

Несмотря на относительную широту возможностей и показаний, недостаток FISH-метода — точечность и специфичность, ведь "добываемая" им информация ограничена участком, с которым реагирует (гибридизируется) соответствующий зонд. Поэтому иногда перед его использованием полезно определить наличие отклонения в определенной области генома другим методом (например, тем же ХМА), а затем уже применить FISH для уточнения структуры изучаемой сложной хромосомной перестройки [3].

Хромосомный микроматричный анализ (ХМА)

В то время как другие цитогенетические методы обнаруживают лишь серьезные изменения числа или структуры хромосом, ХМА опускается на уровень ДНК, позволяя видеть в ней субмикроскопические изменения. Этот мощный диагностический инструмент использует амплификацию всего генома; обильно полученные фрагменты затем гибридизируют с метками или зондами , закрепленными на твердой матрице из кремния или стекла (собственно микрочипе). Такое специфическое связывание позволяет визуализировать множество функционально значимых участков генома и выявлять до нескольких сотен затрагивающих их изменений (рис. 8), — так что этот метод имеет более высокое разрешение, в сравнении с обычной цитогенетикой и FISH-методом.

Закрепляемые на чипе последовательности ДНК недлинные и соответствуют известным локациям на каждой из 46 хромосом набора. Это дает возможность обнаруживать хромосомные изменения и позволяет отнести данный метод к цитогенетическим.

Этапы ХМА:

пробоподготовка образцов анализируемой и референсной (эталонной) ДНК;
амплификация ДНК в подготовленных образцах;
мечение амплифицированных образцов специфичными зондами с флуоресценцией;
гибридизация ДНК полученных проб с комплементарными последовательностями, нанесенными на микрочип;
детекция и анализ данных с чипа на соответствующем оборудовании и программном обеспечении.

Диагностику на базе ХМА рекомендуют при подозрениях на:

задержку развития;
умственную отсталость;
расстройства аутистического спектра;
множественные врожденные пороки развития.

Диагностические возможности

ХМА позволяет выявить почти любые численные и структурные несбалансированные изменения хромосом в рамках его разрешающей способности:

Анеуплоидии [19] — изменения числа одной или нескольких хромосом по сравнению с нормой.
Полиплоидии — кратное увеличение количества всех хромосом.
Делеции и дупликации.
Несбалансированные транслокации — потеря фрагментов одной хромосомы или увеличение участка другой .
Однородительские дисомии — когда человек получает по две копии какой-либо хромосомы (или ее части) от одного родителя (а не от двух), а также участки потери гетерозиготности .
Мозаицизм [20], [21] — присутствие в одном организме клеток с разным набором хромосом (на уровне более 25%).

В отличие от сбалансированных (симметричных, реципрокных) транслокаций, которые может выявить FISH (рис. 6), при несбалансированных транслокациях обмен хромосомным материалом неравный, что приводит к дополнительным или отсутствующим генам.

Это когда теряется одна копия всего гена и окружающего его хромосомного региона. Так как диплоидные клетки имеют по две копии генов (по одной от каждого родителя), другая копия утерянного гена остается.

Так что же для диагностики лучше?

Выбор методов диагностики пока что зависит от конкретного случая и очень индивидуален. На пятки описанным в статье клиническим методикам вовсю наступают еще и методики генетики молекулярной, зачастую имеющие более высокое разрешение (например, полногеномное секвенирование) и уже используемые в некоторых исследовательских центрах. Однозначно, их применение будет расширяться, но вот вытеснят ли они полностью более рутинные (хорошо зарекомендовавшие себя) методы ─ вопрос пока еще дискуссионный. Дело в том, что исследовать весь геном нужно далеко не всегда, а значит, повышение "диагностического потенциала" хоть и является хорошей "заявкой на победу", ─ но это еще далеко не все.

Некоторые цитогенетические методики сумели зарекомендовать себя как "золотой стандарт" для отдельных показаний вовсе не из-за того, что умеют "видеть больше", а просто потому что видят именно то, что нужно, и не требуют особых условий. Они несложны в исполнении (не требуют высококвалифицированного персонала), быстрые, дешевые и высокоспецифичные (надежно обнаруживают именно то, что исследуется, и ничего лишнего). Кроме того, постоянное улучшение этих "зрелых" технологий еще и постепенно выводит их на новый уровень.

Например, автоматизация анализа цитогенетических препаратов значительно улучшила эффективность работы многих лабораторий, а технология ХМА ─ объединяя тысячи нуклеотидов на одном чипе и используя компьютерную обработку для их "обратной сборки в хромосомы", ─ фактически стирает грань между молекулярной генетикой и цитогенетикой. Также на подходе приложения, способные обойти и ограничение дифракционного предела [22], что поможет расширить применение клинически значимых методов флуоресцентной микроскопии (опять же, подняв их возможности до уровня анализа изменений в отдельных молекулах).

Так или иначе — наука не стоит на месте, и ландшафт используемых диагностических методик будет меняться к лучшему.

Первоначальная версия этой статьи опубликована на сайте компании Genetiko.

ДНК-зонды FastProbe^® для экспресс-FISH анализа

Цитогенетический метод — флуоресцентная гибридизация in situ — это мечение целевых последовательностей ДНК для детекции слияния, амплификации, перестроек генов, обнаружения генных и хромосомных аномалий и др. Специфический флуоресцентный зонд конструируется по принципу комплементарности для гена-мишени. Метод FISH позволяет определять генетический статус.

Согласно стандартным протоколам, материал (фиксированные в формалине и заключенные в парафин образцы ткани человека) требует пробоподготовки, которая занимает от 24 часов. Запатентованная технология FastProbe^® позволяет сократить время инкубации гибридизации зондов до 2 часов — вместо 3 суток для обычных зондов.

Неповторяющиеся последовательности ДНК-зондов FastProbe^® обеспечивают высокую чувствительность, специфичность и оптимальное отношение сигнал/шум. Оценка результатов гибридизации требует подсчета и, если в наличии нет автоматического сканера и системы анализа, микроскопия занимает очень продолжительное время. В этом случае эффект антигашения ДНК-зондов FastProbe^® обеспечит возможность длительного наблюдения под флуоресцентным микроскопом.

Набор зондов FastProbe^® снабжается красителем DAPI, достаточным для выполнения окрашивания 10 тестов.

Метод экспресс-FISH анализа позволяет значительно ускорить получение результата и повысить качество исследования.

Официальный дистрибьютор зондов для гибридизации in situ, ООО " Микротесты Б.М.В." обеспечивает нормативную транспортировку и полную сохранность рабочих свойств наборов зондов низкотемпературным режимом размещения при −86 ^oС на складе в Москве. Компания " Микротесты Б.М.В." работает на рынке РФ с 2003 г. и успешно участвует в аукционах и тендерах, предоставляет экспертные консультации.

Диапазон поставляемых зондов включает регулярные поставки наборов зондов со склада производителя в Ухани и реактивы, исполняемые в течение 4–6 недель под индивидуальный заказ.

Высококачественные наборы зондов предлагаются на регулярной основе для изучения следующих заболеваний:

Немелкоклеточный рак легкого:

ALK gene fusion detection probe
6q(ROS1) gene detection probe
MET gene detection probe
MAML2(11q21) gene break apart detection probe
NTRK1 gene break apart detection probe
NTRK2(9q21) gene break apart detection probe
NTRK3(15q25) gene break apart detection probe
PDL1(9p24)/CSP9 gene amplification detection probe

Рак молочной железы

HER2 gene amplification detection probe
TOP2A gene amplification detection probe
ETV6/NTRK3 gene fusion t(12;15) detection probe
CCND1(BCL1) gene amplification detection probe
EPOR(19p13) gene break apart detection probe

Рак мочевого пузыря

Bladder Cancer Cells chromosome and gene anomaly detection probe
CLL chromosome and gene anomaly detection probe

Рак шейки матки

TERC gene amplification detection probe

Опухоли мозга

1p/19q deletion detection probe
BRAF gene break apart detection probe

Лимфомы и другие болезни крови — более 80 наименований наборов зондов.

Таким образом, постоянно расширяющий диапазон маркеров позволяет использовать их для изучения многих нозологий человека.

Принцип метода:

Использование набора для предварительной обработки: образцы ткани в парафине обрабатываются нетоксичным депарафинизирующим агентом, агент для пермеабилизации и пепсин ферментативно разрушают клетки для улучшения качественного или количественного выявления ДНК в ткани.
Денатурация ДНК и гибридизация с зондом (формирование гибридов целевой ДНК с ДНК-зондом).
Промывка для удаления всех негибридизовавшихся зондов.
Окрашивание флуоресцентным красителем DAPI, который проникает через клеточную мембрану, связывается с двухцепочечной ДНК и окрашивает ее в синий цвет.
Визуализация результата под флуоресцентным микроскопом для качественного, количественного анализа или сравнительного позиционирования целевого гена.

Простота исполнения, дешевизна метода и постоянно расширяемый спектр наборов зондов делает методику максимально востребованной в условиях многих исследований.