Микрофлюидный биосенсор на основе Helicobacter pyl...
Микрофлюидный биосенсор на основе Helicobacter pylori: может ли патоген приносить пользу?
25 января 2022, 07:43
Статья на конкурс "Био/Мол/Текст": О чем вы думаете, когда слышите слово "биосенсор"? А "микрофлюидные технологии"? Эти слова кажутся таинственными, даже немного пугающими и как будто взятыми из какой-то научно-фантастической книжки. На самом деле первый биосенсор был создан еще в 1975 году, а микрофлюидным технологиям уже более 30 лет. Биосенсоры бывают очень разными по своей структуре и принципу действия. На сегодняшний день клеточные биосенсоры активно используются для экологического мониторинга токсинов в воде, почве и продуктах питания. Чаще всего чувствительным элементом в таких биосенсорах являются условнопатогенные бактерии, например, кишечная палочка или биолюминесцентные бактерии, обитающие в глубинах моря. Однако получение новых специфических, компактных и недорогих биологических сенсоров и выбор оптимальных микроорганизмов, которые могли бы выступать в качестве чувствительных элементов в таких сенсорах, всегда остается актуальной задачей как для экологии, так и в сфере медицинской диагностики. Мы решили подойти к решению этого вопроса нестандартно: взять грозную патогенную бактерию Helicobacter pylori и с использованием микрофлюидных технологий попробовать получить новый биологический сенсор оптического типа. А о том, как и почему мы это делали, и что же из всего этого вышло, читайте ниже.
Эта работа опубликована в номинации "Своя работа" конкурса "Био/Мол/Текст"-2021/2022. Партнер номинации — компания Cytiva. Генеральный партнер конкурса — международная инновационная биотехнологическая компания BIOCAD. Генеральный партнер конкурса — компания "Диаэм": крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств. "Книжный" спонсор конкурса — "Альпина нон-фикшн"
Helicobacter pylori. Кто он такой?
В 1979 году австралийские патологи Робин Уоррен и Барри Маршалл заинтересовались бактерией спиралеобразной формы, которая обнаруживалась в биопсии пациентов, страдающих гастритом и язвой желудка [1]. Они были первыми, кто смог выделить и изолировать Helicobacter pylori из проб слизистой оболочки желудка человека и классифицировать ее как отдельную бактерию. И именно Уоррен и Маршалл предположили, что большинство язв желудка и гастритов вызваны хеликобактерной инфекцией, а вовсе не стрессом или острой пищей [2]. Этим ребятам потребовалось более 10 лет и одна выпитая Маршаллом жидкая культура Helicobacter, вызвавшая у него острый гастрит, прежде чем научное сообщество в 1994 году признало научную значимость их открытия и вручило им Нобелевскую премию. Этот малыш Helicobacter pylori, из-за которого случился весь сыр-бор, является грамотрицательной бактерией размером всего 3–5 мкм с несколькими хвостиками-жгутиками на одном из концов для быстрого перемещения (рис. 1) [3]. Рисунок 1. Морфология бактерий рода Helicobacter.а — S-форма H. pylori с 5–7 полярными жгутиками. Масштаб поля 0,5 μm. б — Детализация жгутикового крючка. Негативное окрашивание, масштаб 0,05 μm. в — Спиралевидный H. felis с периплазматическими волокнами и биполярными жгутиками. Масштаб 0,5 μm. г — Детализация периплазматического волокна. Негативное окрашивание, масштаб 0,05 μm. [3] Он микроаэрофил, а значит в очень душной и влажной комнате с 5% содержанием CO2 ему совсем не понадобится форточка. А еще никто не разбирается в длительных и стабильных отношениях так хорошо, как H. pylori. Сосуществование этого патогена с человеческой популяцией насчитывает тысячи лет. Исследования в области филогеографии показали, что он с нами (а точнее в нас) по крайней мере с момента начала миграции людей из Африки — около 60 тыс. лет назад [4]. Вот уж и правда "и в горе, и в радости". И это при том, что условия его проживания в желудке человека далеки от пятизвездочного отеля. Ведь наш желудок, по сути, представляет собой бассейн с соляной кислотой (pH около 2,0) и долгое время считался совершенно стерильным [5]. На сегодняшний день H. pylori является единственным известным микроорганизмом, способным длительно выживать в условиях низких значений pH желудочно-кишечного тракта [6]. Более того, иногда бактерия колонизирует человека на протяжении всей жизни. И кстати, если вы считаете, что вас эта инфекция точно обошла стороной — не спешите с выводами. По статистике, данным микроорганизмом инфицировано более половины человеческой популяции, хотя у 80% инфекция никак себя не проявляет [7], а значит, любой из нас может быть счастливым обладателем этого хвостатого микроба. Разумеется, на все нужны ресурсы. И такое длительное сосуществование человека и H. pylori обусловило развитие у патогена узкоспециализированных механизмов адаптации [5]. В их основе лежит целый набор белковых факторов и механизмов вирулентности, которые отвечают за подвижность бактерии, способность выживать в кислой желудочной среде, индуцировать синтез провоспалительных цитокинов, нарушать структуру контактов эпителиальных клеток [6]. Белки — всегда продукт экспрессии соответствующих генов. И для того, чтобы сожительствовать с человеком так долго, H. pylori развил в себе специализированные механизмы генетической регуляции, заточенные на то, чтобы "замечать" малейшие изменения в желудке человека (диета, лекарственная терапия, иммунный ответ) и адаптироваться к ним. Что если использовать это умение H. pylori "чувствовать" в наших интересах?
Клеточные биосенсоры. Удивительные факты из жизни некоторых бактерий
Любая бактериальная клетка — это удивительная мини-фабрика, которая, исходя из своей природной ниши, выработала внутри себя ряд механизмов выживания и адаптации, основой которых являются гены, белки (продукты экспрессии генов) и промоторы, управляющие всеми этими процессами. Промотор — это уникальная последовательность перед геном, которую "узнает" фермент полимераза, взаимодействует с ней и запускает каскад таких процессов, как транскрипция (наработка РНК) и трансляция (наработка белкового продукта) этого гена. Все это называется экспрессией гена, а промотор регулирует эту экспрессию и ее уровень (рис. 2). Рисунок 2. Схематическое изображение процесса экспрессии гена. Экспрессия гена регулируется промотором. ДНК-последовательность гена служит в качестве матрицы для процесса транскрипции (наработка РНК с ДНК-последовательности гена) и последующей трансляции (образование белкового продукта). рисунок автора статьи Есть гены, чьи продукты нужны клетке всегда, поэтому они экспрессируются на постоянном уровне (их называют генами "домашнего хозяйства"). А есть гены, чья экспрессия нужна только в некоторых случаях, например, для защиты клетки от неблагоприятного внешнего воздействия. Такое воздействие называют индуктором промотора. И у одного промотора таких индукторов может быть сразу несколько. Иногда изменение количества белкового продукта в клетке в ответ на индуктор можно легко зарегистрировать, например визуально. Именно это характерно для природных люминесцентных бактерий, таких как Vibrio, Photobacterium, Shewanella (Altermonas) и Photorhabdus (Xenorhabdus), встречающихся, главным образом, в море [8]. В их клетках с помощью целого оперона (несколько объединенных генов), называемого lux-опероном, закодирован белок-фермент люцифераза и его вспомогательные белки, которые, управляя сложным каскадом реакций, инициируют свечение клетки голубовато-зеленым светом — люминесценцию [8]. За регуляцию этого lux-оперона в клетке отвечают стресс-чувствительные промоторы. Соответственно, факторы, воздействующие на эти промоторы, изменяют экспрессию lux-оперона и, как следствие, уровень свечения клетки. А поскольку у хорошей хозяйки все в хозяйстве сгодится, то ученые решили, что негоже таким бактериям просто так пропадать на дне морском и сделали их частью биологического сенсора [9]. Биосенсор — это устройство, в котором чувствительный слой представлен биологическим объектом: клеткой (клеточный биосенсор), ферментом (ферментный биосенсор), антителом (иммуносенсор) или нуклеиновой кислотой (сенсоры на основе ДНК-аптамеров). Этот чувствительный слой реагирует на присутствие определенного компонента в анализируемой смеси и генерирует сигнал (например, в случае люминесцентных бактерий, свечение), пропорциональный количеству этого компонента или факту его наличия/отсутствия [10]. Для каждого вида чувствительного элемента есть свои преимущества и ограничения. Но сенсоры на основе живых клеток значительно стабильнее и дешевле. К тому же уникальная комбинация всех клеточных компонентов позволяет создавать систему, которую невозможно воспроизвести, используя отдельные составляющие. Поэтому уже сейчас в экологии для определения токсичности водных сред на основе люминесцентных бактерий активно используются такие биосенсорные системы, как Microtox в США, LUMItox в Великобритании, ToxAlert в Германии и BioTox в Финляндия [9], [10]. Это клеточные биосенсоры на основе нативных (то есть естественных) бактериальных клеток. Но что делать, если у бактерии есть специфические промоторы, которые чувствительны к специфическим факторам и были бы полезны в биосенсоре, но продукт экспрессии этих генов не удобно регистрировать? Ну не светятся они в обычной жизни. Не хочешь? Поможем. Именно здесь на сцену выходит великая и ужасная генная инженерия, благодаря которой, кстати, человечество получило устойчивую к засухе пшеницу и холодоустойчивые томаты, более крупный картофель и устойчивые к паразитам яблоки и бананы [11]. Как? Если кратко, то с помощью генно-инженерных методов мы можем внести в клетку дополнительные гены или целые гибридные последовательности таким образом, чтобы клетка производила нужные нам белки в большем объеме или приобретала благодаря им новые качества [12]. Кстати, именно генномодифицированные бактерии производят для нас в огромных масштабах гормоны инсулин и эритропоэтин, а также различные витамины и антибиотики, которые многим людям просто жизненно необходимы [12]. На сегодняшний день вариантов и подходов к модификации растений и микроорганизмов в генной инженерии существует очень много. Но в нашем случае, для получения клеточного биосенсора на основе генетически модифицированных бактерий, наиболее простым подходом является использование репортерной конструкции (рис. 3) [7], [13–16]. Чаще всего репортерная конструкция представляет собой кольцевую ДНК (плазмиду), которая может быть внесена в клетку и существовать в ней автономно. В состав такой плазмиды мы можем поместить выбранный нами чувствительный к специфическим воздействиям промотор данного микроорганизма таким образом, чтобы он регулировал экспрессию выбранного нами гена-репортера (это ген, продукт которого легко регистрируется — например, зеленая или красная флуоресценция или люминесценция). Рисунок 3. Упрощенная схема принципа действия биосенсора на основе модифицированных клеток с использованием репортерной конструкции. В составе конструкции чувствительный промотор объединен с геном-репортером, контролируя его экспрессию. Конструкция внесена в клетки путем клеточной трансформации. В результате внешнего воздействия на такие модифицированные конструкцией клетки происходит активация стресс-чувствительного промотора, экспрессия гена-репортера и последующая продукция репортерного белка. [7], рисунок изменен и адаптирован Итак, резюмируем. Мы выбираем интересный микроорганизм с необычным, специфическим промотором, чувствительным к определенному веществу, которое нам хотелось бы детектировать. Затем мы "собираем" для него репортерную конструкцию, которая содержит ген-репортер под контролем стресс-чувствительного промотора и вносим эту конструкцию в клетки (генетически модифицируем наш микроорганизм). Если в среде оказывается вещество-индуктор, к которому чувствителен наш промотор, — промотор активирует экспрессию гена-репортера, в клетке происходит продукция репортерного белка, и мы видим клеточный сигнал — вуаля! Мы детектируем данное вещество в среде благодаря тому, что модифицированные клетки меняют свою флуоресценцию/люминесценцию в ответ на вещество-индуктор. На основе таких модифицированных микроорганизмов уже получен ряд биосенсоров, с помощью которых успешно детектируют тяжелые металлы в среде и почве, токсины в подземных водах, ядовитые соединения в воде и антибиотики в почве и в продуктах питания. Наиболее популярным микроорганизмом для модификации и использования в таких биосенсорах является условно патогенная бактерия E. coli или кишечная палочка [17]. Однако потребности человечества в новых специфических системах детекции и новых микроорганизмах для этих целей с каждым днем только растут. Каждый микроорганизм уникален, и чем необычнее его биологическая ниша и способы адаптации к ней, тем специфичнее его промоторы. Вот так мы и решили заставить нашего грозного патогенного малыша H. pylori приносить пользу, генетически модифицировав его с помощью репортерной конструкции и сделав его частью клеточного биосенсора.
"ГМОшная" бактерия. Как и зачем научить H. pylori флуоресцировать
Как мы знаем, H. pylori сам по себе не умеет светиться в темноте подобно люминесцентным бактериям. Это, конечно, очень досадно, ведь тогда в желудке его бы было отлично видно. Но нам в нем интересно другое. У него есть ряд уникальных стресс-чувствительных промоторных последовательностей, которые мы могли бы использовать. Гены, которые регулируются этими промоторами, кодируют белки вирулентности H. pylori, помогают ему колонизировать желудок и реагируют на присутствие самых разнообразных факторов. Здесь и снижение кислотности среды, и осмотический и окислительный стрессы и изменение концентрации ионов металлов (таких как никель и железо), и взаимодействие с эпителиальными клетками [5]. Из этого многообразия мы решили выбрать для нашей последующей работы промоторы двух генов, кодирующих белки, критически важные для колонизации H. pylori: субъединицу А фермента уреазы и вакуолизирующий цитотоксин [3], [4]. Уреаза и есть тот философский камень, который синтезируется в клетке H. pylori и помогает ему выживать внутри нас. Только превращает он не металл в золото, а мочевину в аммиак и СО2. Аммиак защелачивает pH до значений 6,0–7,0 вблизи бактерии, делая окружающую среду пригодной для выживания. Промотор гена, кодирующего субъединицу А уреазы, P ure, чувствителен к снижению pH и повышению концентрации ионов никеля. В ответ на эти воздействия экспрессия гена возрастает [18]. И если уреаза — щит H. pylori, то вакуолизирующий цитотоксин VacA — один из его мечей. Это уникальный и очень агрессивный белок, активность которого может быть высокой или низкой в зависимости от штамма [3]. Кстати, в том числе и с вариативностью VacA в разных штаммах связана разнородность симптоматических проявления инфекции у пациентов [19]. В своем самом агрессивном варианте, цитотоксин, секретируемый H. pylori, "дырявит" клетки желудочного эпителия, образуя в них анионные каналы. В результате этого эпителиоциты из-за разницы осмотического давления разбухают (вакуолизируются), лопаются и гибнут [20]. Промотор гена, кодирующего этот цитотоксин, P vac, чувствителен к осмотическому стрессу (повышение соли в среде) и к снижению концентрации ионов железа [21]. Итак, мы выбрали промоторы и то, что будем детектировать с их помощью. Затем, для того, чтобы сделать генно-инженерную репортерную конструкцию, мы позаимствовали из клеток H. pylori его же природную плазмиду, которая встречается в клетках примерно 50% штаммов H. pylori [22]. С ее помощью мы решили научить нашего H. pylori светиться зеленым светом. Для этого, используя генно-инженерные методы, мы интегрировали в плазмиду ген-репортер gfp, продуктом экспрессии которого является тот самый зеленый белок GFP, благодаря которому светятся медузыAequorea victoria [23]. А для того, чтобы ген экспрессировался (то есть чтобы происходила продукция GFP в клетках и они светились), мы "поставили" перед ним два наших промотора H. pylori P vac и P ure. Итак, на основе нашей одной природной плазмиды мы сделали для H. pylori целых две репортерные конструкции, содержащие ген gfp под контролем двух критически важных промоторов H. pylori. В одной конструкции P ure, в другой P vac. Затем мы внесли эти конструкции в клетки H. pylori (модифицировали их) и получили два генно-модифицированных штамма, которые светятся зеленым светом благодаря продукции GFP в клетках. Теперь один штамм (с P ure) должен детектировать повышение кислотности и повышение ионов никеля, флуоресцируя сильнее. Другой штамм (с P vac), по тому же принципу, должен определять повышение соли в среде и снижение концентрации ионов железа. Но как нам проверить их работоспособность? И каким вообще может быть биосенсор на основе таких клеток?
H. pylori + микрофлюидный чип: "Задетектируем это!"
В случае с H. pylori не все так просто. Для этой бактерии важно анализировать единичные клетки, так как известно, что данная бактерия высоко гетерогенна [3]. Это понятие означает, что внутри клеточной популяции каждая клетка индивидуальна и отвечает на внешний стимул по-своему, со своей интенсивностью. То есть если мы будем просто регистрировать общую флуоресценцию клеточной популяции, то результат будет чем-то вроде средней температуры по больнице — не достоверным. К тому же важной характеристикой биосенсора является не только его чувствительность и специфичность, но и его компактность. Поэтому, для решения этой комплексной задачи, мы решили использовать микрофлюидные технологии [24]. Этот подход позволяет не только миниатюризировать инструменты исследования (ведь масштабы микрофлюидики это 1–1000 микрон, а 1000 микрон = 1 мм) (рис. 4), но и, как следствие, сократить объем пробы, а также во многом автоматизировать весь эксперимент [25]. Рисунок 4. Упрощенная шкала масштабов применения нано- и микрофлюидных технологий. С помощью нанотехнологий ученые работают с ДНК, белками и вирусами, в то время как микрофлюидика позволяет анализировать прокариотические и эукариотические единичные клетки. рисунок автора статьи Кроме того, мы сможем анализировать ответ единичных клеток, наблюдать их морфологию и очень тонко регулировать условия воздействия на клетку. Такие технологии уже активно используются для различных фундаментальных и прикладных исследований. Поэтому мы решили, что наш биосенсор на основе флуоресцентных клеток H. pylori будет представлять собой микрофлюидный чип с закрепленными в контрольном и индуцированном каналах единичными клетками. Добавляя в индуцируемые каналы анализируемую смесь (аналит), мы сможем детектировать изменение флуоресценции единичных клеток с помощью микроскопа и сравнивать с контрольным каналом. Увеличение интенсивности флуоресценции будет говорить нам о присутствии определенного фактора в аналите. То есть клетки будут его детектировать. Важно, чтобы себестоимость биосенсора была невысокой. Поэтому наш чип, заточенный специально под малыша H. pylori, представлял собой трехслойную конструкцию (рис. 5), состоящую из: i) слоя ПММА ( полиметилметакрилата), в котором с помощью углекислотного лазера были сформированы два канала; ii) промежуточной "склеивающей" прокладки из композитных материалов; iii) покровного стекла, которое обеспечивало защиту каналов. Размер финальной конструкции составлял всего лишь 7,5×2,5 см (рис. 5). Все эти материалы имеют очень невысокую себестоимость и отлично подходят для одноразового использования. Так, ПММА активно применяют при изготовлении одноразовой лабораторной посуды для культивирования клеточных культур, а покровные стекла знакомы нам еще со школы, и их широко используют при различных микроскопических исследованиях. Рисунок 5. Оригинальная конструкция микрофлюидного чипа ( слева) и его фотография в собранном виде ( справа). На изображении слева сверху вниз показаны ПММА-основа, "склеивающая" прокладка и покровное стекло. рисунок автора статьи Мы помнили, что H. pylori очень подвижен благодаря жгутикам на одном из его концов, а скорость его движения превышает таковую у других бактерии [26]. Это препятствует фокусировке микроскопа на единичных клетках. Поэтому чтобы легко регистрировать флуоресценцию неподвижных единичных клеток в канале чипа, мы модифицировали каналы таким образом, чтобы бактериальная клетка была закреплена. Мы использовали свойство адгезииH. pylori, благодаря которому он активно прикрепляется к эпителиоцитам [20], и сделали многослойную модификацию каналов с помощью полиалиламина, глутарового альдегида и затем смеси белков клеточной адгезии (конканавалина и фибронектина). Такая "мягкая перинка" в канале чипа с одной стороны была довольно естественным окружением для H. pylori, а с другой обеспечила нам неподвижность клеток и удобство наблюдения в микроскоп. Один канал чипа служил нам в качестве контроля, а в другой мы добавляли среду, содержащую индукторы наших промоторов для проверки эффективности биосенсора. Для регистрации флуоресценции клеток в каналах мы использовали EMCCD-камеру и эпифлуоресцентный микроскоп с системой поддержания автофокуса. Мы получали фотографии клеток в канале. Далее мы выбирали клетки "вручную" с помощью компьютерной мыши в программном обеспечении микроскопа и нормировали значения флуоресценции единичной клетки на ее площадь (рис. 6). Полученные значения в индуцированном канале мы сравнивали с контрольным каналом. Так как мы выбирали только те клетки, которые характеризовались нормальной морфологией и были в фокусе, то успешно учитывали гетерогенность нашей клеточной популяции и регистрировали флуоресценцию только "здоровых" и живых клеток. Рисунок 6. Иллюстрация обработки данных, полученных с помощью EMCCD-камеры в программном обеспечении эпифлуоресцентного микроскопа. Снимок компьютерного экрана. Слева единичные клетки H. pylori в одной из областей в канале чипа, на которой сфокусирован микроскоп. Справа график распределения интенсивности клеточной флуоресценции в канале чипа для выбранной области поля. На графике видно, что клеточная флуоресценция представляет собой не единичное значение, а множество различных значений интенсивности от каждой клетки (распределение Гаусса), что подтверждает неоднородность (гетерогенность) клеточной популяции. изображение получено автором статьи В результате, полученные нами модифицированные клетки H. pylori не только стабильно флуоресцировали в каналах чипа, но уже через два часа значительно увеличивали уровень флуоресценции в ответ на различные факторы, которые мы добавляли в среду (рис. 7). Рисунок 7. Изменение флуоресценции клеток H. pylori, трансформированных репортерными конструкциями в ответ на присутствие индуктора в аналите.Слева: Изменение флуоресценции клеток, содержащих gfp под контролем P ure в ответ на pH 5,5 (добавление HCl) и добавление 100 µМ NiCl2 в течении 24 часов после добавления индукторов. Справа: Изменение флуоресценции клеток, содержащих gfp под контролем P vac в ответ на осмотический стресс (добавление 1% NaCl) и снижение концентрации железа (добавление 75 µM 2′2-дипиридила) в течение 24 часов после добавления индукторов. рисунок автора статьи Причем изменение клеточной флуоресценции можно было зафиксировать даже визуально (рис. 8). Кроме того, наблюдая за клетками в канале чипа на протяжении 24 часов, мы видели, что все это время они сохраняли нормальную морфологию. Рисунок 8. Микрофотография зафиксированных единичных флуоресцирующих клеток H. pylori в каналах чипа, содержащих gfp под контролем P ure и P vac. В каждом случае показаны клетки в контрольных и индуцированных каналах. изображение получено автором статьи Итак, нам удалось собрать оригинальный микрофлюидный чип, который позволяет успешно закреплять и длительно культивировать клетки H. pylori, изучая поведение единичной бактериальной клетки [27], [28]. Более того, в случае использования модифицированных флуоресцентных клеток H. pylori такая система "чип + клетки" может служить прототипом биосенсора. Мы успешно детектировали с помощью этой системы такие факторы, как снижение pH, увеличение концентрации ионов никеля, снижение концентрации ионов железа, а также осмотический стресс. Такой подход открывает удивительные возможности в дальнейшем. Благодаря использованию микрофлюидных технологий, вся механика эксперимента на чипе может быть доведена практически до полного автоматизма, что также значительно увеличит скорость и упростит систему. При этом сам процесс изготовления чипа, себестоимость его составляющих и небольшой расход реактивов обеспечивает системе дешевизну. Бактерия H. pylori обладает большим спектром специфических промоторов, а значит, в дальнейшем, можно собирать самые разные репортерные конструкции и получать модифицированные штаммы H. pylori, способные детектировать еще большее количество различных специфических факторов в области низких концентраций. Потенциально, такую систему можно адаптировать для использования в ранней диагностике следовых маркеров иммунитета человека. Помимо этого, ничто не мешает успешно применять ее для тестирования лекарственных препаратов и совершенствования подходов в антихеликобактерной терапии. Сколько же еще заманчивых перспектив нам откроется в случае таких биосенсоров на основе H. pylori? Время покажет.
Партнер номинации — компания Cytiva. 
Генеральный партнер конкурса — международная инновационная биотехнологическая компания BIOCAD. 
Генеральный партнер конкурса — компания "Диаэм": крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств. 
"Книжный" спонсор конкурса — "Альпина нон-фикшн" 
Рисунок 1. Морфология бактерий рода Helicobacter. а — S-форма H. pylori с 5–7 полярными жгутиками. Масштаб поля 0,5 μm. б — Детализация жгутикового крючка. Негативное окрашивание, масштаб 0,05 μm. в — Спиралевидный H. felis с периплазматическими волокнами и биполярными жгутиками. Масштаб 0,5 μm. г — Детализация периплазматического волокна. Негативное окрашивание, масштаб 0,05 μm. [3]
Рисунок 2. Схематическое изображение процесса экспрессии гена. Экспрессия гена регулируется промотором. ДНК-последовательность гена служит в качестве матрицы для процесса транскрипции (наработка РНК с ДНК-последовательности гена) и последующей трансляции (образование белкового продукта). рисунок автора статьи
Рисунок 3. Упрощенная схема принципа действия биосенсора на основе модифицированных клеток с использованием репортерной конструкции. В составе конструкции чувствительный промотор объединен с геном-репортером, контролируя его экспрессию. Конструкция внесена в клетки путем клеточной трансформации. В результате внешнего воздействия на такие модифицированные конструкцией клетки происходит активация стресс-чувствительного промотора, экспрессия гена-репортера и последующая продукция репортерного белка. [7], рисунок изменен и адаптирован
Рисунок 4. Упрощенная шкала масштабов применения нано- и микрофлюидных технологий. С помощью нанотехнологий ученые работают с ДНК, белками и вирусами, в то время как микрофлюидика позволяет анализировать прокариотические и эукариотические единичные клетки. рисунок автора статьи
Рисунок 5. Оригинальная конструкция микрофлюидного чипа ( слева) и его фотография в собранном виде ( справа). На изображении слева сверху вниз показаны ПММА-основа, "склеивающая" прокладка и покровное стекло. рисунок автора статьи
Рисунок 6. Иллюстрация обработки данных, полученных с помощью EMCCD-камеры в программном обеспечении эпифлуоресцентного микроскопа. Снимок компьютерного экрана. Слева единичные клетки H. pylori в одной из областей в канале чипа, на которой сфокусирован микроскоп. Справа график распределения интенсивности клеточной флуоресценции в канале чипа для выбранной области поля. На графике видно, что клеточная флуоресценция представляет собой не единичное значение, а множество различных значений интенсивности от каждой клетки (распределение Гаусса), что подтверждает неоднородность (гетерогенность) клеточной популяции. изображение получено автором статьи
Рисунок 7. Изменение флуоресценции клеток H. pylori, трансформированных репортерными конструкциями в ответ на присутствие индуктора в аналите. Слева: Изменение флуоресценции клеток, содержащих gfp под контролем P ure в ответ на pH 5,5 (добавление HCl) и добавление 100 µМ NiCl2 в течении 24 часов после добавления индукторов. Справа: Изменение флуоресценции клеток, содержащих gfp под контролем P vac в ответ на осмотический стресс (добавление 1% NaCl) и снижение концентрации железа (добавление 75 µM 2′2-дипиридила) в течение 24 часов после добавления индукторов. рисунок автора статьи
Рисунок 8. Микрофотография зафиксированных единичных флуоресцирующих клеток H. pylori в каналах чипа, содержащих gfp под контролем P ure и P vac. В каждом случае показаны клетки в контрольных и индуцированных каналах. изображение получено автором статьи